Neuroni
Open Science U.M.F. Craiova
Neuroni
Celule marcate cu NeuN
După secționarea creierului folosind un vibrotome, țesutul obținut a fost manipulat atent pentru a preveni deteriorarea, utilizând o ansă, introdusă ușor sub secțiune, ridicând-o cu grijă pentru a preveni ruperea sau deformarea acesteia. Secțiunile au fost transferate imediat într-un recipient cu PBS, pentru a fi menținute hidratate și stabile din punct de vedere al pH-ului, prevenind astfel deshidratarea și deteriorarea țesutului, apoi au fost păstrate în PBS la 4°C până la realizarea imunohistochimiei, nu mai mult de 24 de ore.
Secțiunile au fost transferate în placă, individual în fiecare godeu, în care se afla PBS. Ulterior PBS-ul a fost aspirat cu o pipetă și înlocuit cu blocking solution (BS) (0,5% Triton X-100, 5% horse serum în PBS) la temperatura camerei, timp de o oră, apoi au fost incubate cu mouse NeuN monoclonal (Invitrogen, MA5-33103, la o dilitie de 1:500) peste noapte, la 4°C, în întuneric.
În ziua următoare, după ce secțiunile au fost spălate cu PBS timp de 10 minute x 3, au fost incubate cu Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571, dilutie 1:1000) timp de 2 ore, la temperatura camerei, în întuneric.
După incubarea anticorpilor secundari, secțiunile au fost respălate cu PBS timp de 10 minute de trei ori consecutiv și au fost montate pe lame.
Pe lamă a fost plasată o picătură de PBS suficient de mare pentru a acoperi întreaga secțiune de țesut. Cu ajutorul unei anse, s-a preluat cu grijă secțiunea din godeu și a fost transferată în picătura de PBS de pe lamă. Secțiunea a fost ajustată cu o pensă pentru a fi plată și uniform întinsă, evitându-se manipularea excesivă. Excesul de PBS a fost îndepărtat cu o pipetă și un șervețel absorbant de pe marginea lamei, fără a perturba secțiunea, apoi a fost acoperită cu mediu (Fluoromount-G with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (ThermoScientific, 00-4959-52)) și a fost așezată cu grijă lamela. Toate lamele astfel obținute au fost izolate folosind o soluție de acrilat incolor aplicat pe marginea lamelei cu ajutorul unei pensule
Imagine (447.63x335.40 micrometrii), achizitionat cu un obiectiv Pan-Apochromat 20x/0.8 M42