Astrocite-Canal de apa AQP4 - Celule musculare netede
Open Science U.M.F. Craiova

Astrocite-Canal de apa AQP4 - Celule musculare netede

GFAP-rosu. AQP4-alb. SMA-verde_AX confocal_60x

- Se deparafineaza lamele in 3 bai de xilen consecutive, cate 5 minute in fiecare baie;
- Se lasa sa se usuce sectiunile, iar dupa ce s-au uscat se traseaza un cerc in jurul tesutului cu un marker hidrofob (ImmEdge Hydrophobic Barrier PEN, Vector Laboratories);
- Se rehidrateaza sectiunile in 3 bai cu concentratii descrescatoare de etanol: 100%, 90%, 70%, cate 5 minute in fiecare;
- Se aduc sectiunile in apa distilata, 5 minute;
- Se fierb sectiunile intr-o solutie de tampon citrat (0.1M, pH=6) intr-o vascheta din plastic termorezistenta acoperita cu capac, intr-un cuptor cu microunde, la 650W, pentru 7 cicli a cate 3 minute; dupa fiecare ciclu de fierbere se completeaza cu solutie proaspata de citrat, astfel incat sa nu se usuce sectiunile;
- Se lasa sa se raceasca vascheta cu lame si tampon citrat la temperature camerei;
- Se spala cu apa de robinet din abundenta;
- Se muta sectiunile in solutie tampon fosfat salin PBS 1X, 5 minute;
- Se aseaza sectiunile intr-o tava de sticala termorezistenta (Pirex) si se bastreaza pentru 1h sub sursa LED 5000K pentru scaderea autofluorescentei tisulare;
- Se spala sectiunile intr-o solutie proaspata de tampon PBS, 5 minute;
- Se incubeaza lamele intr-o solutie de 5% lapte degresat (skimmed milk, Biorad, 1706404XTU) pentru 30 de minute;
- Se scot lamele din solutia de blocare, se tamponeaza cu grija excesul de lichid cu un servetel, si se asaza sectiunile intr-o cutie de incubare cu capac, in care s-a turnat in prealabil apa pentru a mentine o atmosfera umeda;
- Se pipeteaza pe fiecare sectiune un volum de 100-150µL de solutie mix anticorp primar care contine: Mouse anti-SMA (1:200, Dako, M0851), Rabbit anti-AQP4 (1:2000, Santa Cruz, sc-20812) si Chicken anti-GFAP (1:500, GeneTex, GTX 85454);
- Se incubeaza pentru 18 ore in frigider la 4C, in cutia de incubare cu capac;
- Se spala sectiunile de trei ori in solutie tampon fosfat PBS 1X, 10 minute, la temperatura camerei;
- Se pipeteaza pe fiecare sectiune un volum de 100-150µL de solutie mix anticorpi secundari care contine: Goat anti-mouse Alexa488 (Invitrogen, 1:300), Goat anti-rabbit Alexa594 (Invitrogen, 1:300), Goat anti-chicken Alexa647 (Invitrogen, 1:300), si se incubeaza in camera intunecata la temperatura camerei pentru 2h.
- Se spala sectiunile de trei ori in solutie tampon fosfat PBS 1X, 10 minute.
- Se spala sectiunile in apa distilata, 3 x 5 minute.
- Se acopera cu lamele utilizand un mediu de acoperire pentru protectia fluorescentei cu DAPi (Vectashield with DAPI, Vector Labs, H-1200-10).
- Se sigileaza lamelele pe lame utilizand lac de unghii.
- Se captureaza imagini utilizant sistemul confocal Nikon AX-R in modul confocal clasic sau super-rezolutie NSPARC.